描述：

L6是一种从大鼠骨骼肌中分离得到的成肌细胞系，由D. Schubert提交保藏

L6 大鼠成肌细胞 基本信息

培养条件

操作步骤

复苏：

1. 从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速轻轻晃动，使冻存液迅速融化。解冻速度应快（大约2分钟）。为了减少污染的可能性，保持o形圈和封盖远离水。

   建议:复苏前10 min从液氮罐取出，放于-80℃，让管中液氮挥发，防止炸管。

2. 一旦将细胞解冻，就立即将冻存管从水浴中取出，并通过浸入或喷洒70%的乙醇来去污。从现在起所有的操作应在严格的无菌条件下进行。 将细胞悬液转移到含有9.0 mL完全生长培养基的离心管中。并以大约125 x g旋转5到10分钟。

3. 弃出上清液，加入适当的新鲜生长培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。并分配到适当数量的培养瓶中。在细胞的恢复过程中，避免培养基的过度碱度是很重要的。建议在添加小瓶内容物之前，将含有完全生长培养基的培养容器置入培养箱中至少15分钟，以使培养基达到其正常的pH值（7.0至7.6）。

4. 在合适的培养箱中培养至37℃。

  传代：

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

• 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次。

• 加入0.25%胰酶消化液，放置在37°℃的培养箱中，通常5-15分钟，即可消化下来  

• 放入1.5ml锥型离心管中，800转每分钟，离心3分钟，目的是除去细胞碎片等其他杂质，使细胞更加干净将离心管中上清液吸出，只留下沉淀，再加入新鲜的完全培养基，吹打均匀后加入到细胞瓶中或者平皿中

• 将细胞悬液按1:20-1:40比例，分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养

注意：为了避免结块，不要通过撞击或摇晃培养瓶来刺激细胞 在等待细胞分离的时候。难以分离的细胞可以放置在37℃以便于扩散。

冻存：

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面10cm皿为例;

收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，加 1 mL新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数。根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度2×10^6-1×10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液在冻存管上做好标识，包括细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作者姓名根据冻存液种类和冻存设备选择对应冻存步骤。记录冻存管位置以便下次拿取。若选用通用细胞冻存液或自配冻存液（冻存液配制：90%FBS+10%DMSO，现用现配），细胞分装完后将冻存管放入梯度降温盒直接放置于-80℃冰箱中。若不是用程序降温盒，则按照下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化。若选用无血清细胞冻存液，可用无血清细胞冻存液重悬细胞后，直接将冻存管分散放入-80℃冰箱中。过夜后即可将细胞转移入液氮长期保存。

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