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细胞房消毒方案-让您的细胞高枕无忧
来源: | 作者:佚名 | 发布时间: 2021-07-29 | 839 次浏览 | 分享到:



细胞形态异常主要原因有哪些?我们应该从哪些方面出发考虑,逍鹏生物以鱼骨模型为大家列举了六大考虑因素,今天我们将带领大家分析人为操作/环境因素。(点击此查看鱼骨图)

人为操作和环境我们大致可以从以下几点进行考察分析:

操作人员、细胞房、生物安全柜、显微镜置物台、二氧化碳培养箱、水浴锅、震动、灭菌锅。



人源污染及预防



从人身上掉落的颗粒达到104/分钟(颗粒直径0.5μm)


人类1小时会脱落3*104-4*104个细胞;1年大概会脱落3.6kg的死细胞。


人类的皮肤总面积约2m2,存在约1012个微生物;我们1g的排遗物中约有1012个微生物。            

-摘自上海高中生物第四册第一章微生物



人源污染


那么我们如何避免这些呢?接下来继续探讨~


01.细胞房着装要求


操作细胞培养物前后应洗手,穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染,还可降低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。

正确的穿衣顺序

          • 换专用鞋

          • 无尘手套(避免不洁的双手经穿着时沾附于无尘衣上)

          • 网帽(带网帽时须确保头发不可暴露于网帽外,之后戴口罩遮住口鼻)

          • 无尘服(不要穿棉质衣服(脱落纤维))

          • 鞋套

德克龙(聚酯)


02.超净台试剂布局


超净工作台或安全柜里的物品摆放一般遵循以下右手使用习惯,并可根据特殊实验中增加物品进行相应的改动。


            • 在工作台中部开阔区域放置细胞培养容器;

            • 移液器置于右前方易于取用的地方;

            • 试剂和培养基置于右后方,便于吸取;

            • 试管架置于中后部,用于固定其他试剂;

            • 小型容器置于左后部,用于盛放废液。




适合惯用右手的工作人员的工作台基本布局。惯用左手的工作人员可相应地调整工作台面上物品的摆放位置。


03.人为操作技巧


            1. 小心取用无菌实验物品,勿碰触吸管尖头部或容器瓶口,也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

            2. 每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同也不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以75%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。

            3. 离心管、冻存管等容器需用抗酒精的标记笔标示内容物名称、操作日期、操作人员姓名。若是细胞传代培养,更需注明目前的代数,以及这是同一代中的第几盘。



细胞房布局技巧

01.细胞房功能分区


理想的无菌操作室应划分为三部分:

a) 更衣室---放在外,主要提供更换衣帽,鞋子,口罩,手套等。
b)缓冲室---位于更衣间与操作间之间,也可同时和几个操作间相通。目的是保证操作间的无菌环境,同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。
c)操作室---放在内间,分为无菌操作室、培养室、准备室、清洗室、消毒灭菌室、储存室。

房间设置要求:各个房间高度适宜(不超过2.5m),顶部过高会影响紫外线的灭菌效果;大小适当,房间过大,清扫和消毒不便;过小,操作不便;墙壁应光滑无死角,以便清洗和消毒。




02.细胞房设计原则及条件


设计原则:防止微生物污染和有害因素影响。

条件要求:

封闭、正压:隔离门和空调系统
温湿度:培养箱内是37℃,饱和湿度;室内是温度18℃-26℃,湿度是45%-65%。
洁净度:空气洁净度等级是洁净空间单位体积空气中,以大于或等于被考虑粒径的离子最大浓度限值进行划分的等级标准。洁净度等级应在空态、静态和动态放大进行测试,使用尘埃粒子测试仪来测定。




03.细胞房布局原


摘自:《Culture of Animal Cells》

细胞房维护保养:


1. 每天检查并记录细胞房温度、相对湿度(细胞房温湿度记录表),发现异常要及时报告并处理。

2. 生物安全柜或超净台维护:每年委托有资质第三方对生物安全柜或超净台进行风速、气流流型、高效测漏、尘埃粒子、沉降菌的检测。

日常维护:定期对生物安全柜或超净台进行尘埃粒子、沉降菌或浮游菌的测试,发现不合格及时更换滤网或进行维修。

3. 空调系统维护: 定时更换初中效过滤器,每年请有资质第三方对洁净室进行尘埃粒子、沉降菌或浮游菌、换气次数、高效测漏、压差等检测。

日常维护:按照要求定期监测尘埃粒子、沉降菌或浮游菌。


细胞房消毒方法


01.细胞培养箱防菌试剂


Pharmacidal (IC-110100)


主要成分:Pharmacidal 是由筛选过的有机氮化合物组成,主要组成成分为:苄基二甲基辛基氯化铵、苄索氯铵、氯化苄乙基铵、三羟乙基胺,并添加丙二醇等清洁消毒剂。

作用原理:

Pharmacidal作用方式是使脂质变性,分解细胞膜的双层磷脂质和增加细胞通透性,导致酶的灭活,蛋白质沉淀,与DNA和RNA产生反应。


特点:

1. Pharmacidal 对大部分的细菌、芽孢、支原体、真菌(酵母菌、霉菌)和病毒都有效。


2. 不含汞、甲醛、苯酚和酒精,可生物降解、无毒、无刺激,对一般的工作台面和器材没有腐蚀性和任何损伤。

使用方法:

1.可消毒橡胶手套、超净台面、桌面、显微镜台、试剂瓶身等物体表面,喷涂完全湿润,不需擦拭,自然风干。


2.培养箱内壁喷涂完全湿润后,等待10分钟后,用无菌吸水纸吸干内壁上的残留液体。


02.水浴锅、水盘防菌试剂




Aquaguard-1 

货号:01-867-1B

主要成分:苯甲酸钠




Aquaguard-2

货号:01-916-1B

主要成分:2-溴代-2-硝基-1,3-丙二醇


Aquaguard-1


用来消毒培养箱中的水盘,可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌(酵母菌、霉菌)和病毒;无毒;对不锈钢无腐蚀性;不挥发。


用法:


1. 建议每两周进行一次系统的清洁和消毒培养箱。


2. 稀释100倍即可使用,即将1L水中加入10ml的Aquaguard-1溶液。

Aquaguard-2

用来消毒水浴锅,可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌(酵母菌、霉菌)和病毒。

用法:

1. 建议每周进行一次系统的清洁和消毒水浴锅。

2. 稀释500倍即可使用,即将1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。


03.超净台、桌面、试剂瓶身消毒方案


灭菌方法

作用原理

优点

缺点

Pharmacidal  喷壶

(季铵盐:苄基二甲

基辛基氯化铵、苄索

氯铵、氯化苄乙基铵、

三羟乙基胺)

季铵盐作用方式是使脂质变性。分解细胞膜的双层磷脂和增加细胞通透性,导致酶失活,蛋白沉淀,与DNA和RNA产生反应,可有效防止真菌、细菌(和芽孢)和包膜病毒(包括HIV等RNA病毒)的污染和生长。

灭菌彻底;无毒无

害;无刺激性;无

腐蚀性;可生物降

不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用,也不能与碘或过氧化物(如高锰酸钾、过氧化氢、磺胺粉等)同用,否则会抵消其作用。

酒精

乙醇的抗菌原理是使蛋白质变性

高效灭菌;价格

实惠

易挥发,作用时间短;有刺激性;易燃

新洁尔灭

(苯扎溴铵)

季铵盐类消毒剂属于阳离子表面活性剂,能吸附带阴离子的细菌并破坏细菌的细胞膜,增加细菌胞浆膜通透性, 使菌体胞浆物质外渗,阻碍其代谢而起到杀灭作用。

可杀灭常见细菌、

真菌;刺激性低;

无腐蚀

  不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用,也不能与碘或过氧化物(如高锰酸钾、过氧化氢、磺胺粉等)同用,否则会抵消其作用。

来苏尔

(甲酚)

酚类可裂解并穿透细胞壁,使菌体蛋白凝集沉淀,快速杀

灭细胞。

可杀灭常见细菌、

真菌

刺激性强,易使橡胶制品变脆变硬

滴露

(对氯间二甲苯酚)

酚类可裂解并穿透细胞壁,使菌体蛋白凝集沉淀,快速杀

灭细胞。

可杀灭常见细菌、

真菌

刺激性强,易使橡胶制品变脆变硬


04.细胞房空气消毒方案


灭菌方法

作用原理

优点

缺点

紫外线灯杀菌

波长在220-300nm的紫外线称为“杀生命区”,其中以260nm的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA,使DNA链上相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体(如胸腺嘧啶二聚体),抑制了DNA复制。

能有效杀灭常见的微生

物如金黄色葡萄球菌、

大肠杆菌

穿透力差;有死角;与被照物的距离以不超过1.2m为宜;致癌

高锰酸钾-甲醛

熏蒸

它能与蛋白质中的氨基酸结合而使蛋白变性,使酶的活性消失。

灭菌彻底;不易燃、

不爆炸,不腐蚀金属

残留性大;致癌

过氧化氢-过氧乙酸

干雾灭菌

通过复杂的化学反应解离具有高活性的羟基作用于细胞膜,其强氧化性破坏组成细菌的蛋白质,使之死亡。

灭菌彻底;残留性小

有腐蚀;易爆;致癌

臭氧灭菌

高压电场使电子管的内外电极发生强烈电子轰击,导致空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧不稳定,很快自行分解成氧气(O2)和单个氧原子(O);后者具有很强的活性,能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应,从而靠氧原子的弥漫性扩散达到杀菌之目的。

 灭菌彻底;残留性小

费用较为昂贵

空气过滤

(恒温恒湿装置)

逐次使用不同孔径的滤膜将微生物过滤干净

除菌效果高;无毒

费用较为昂贵


05.细胞房地面消毒方案


灭菌剂

作用原理

优点

缺点

Pharmacidal 喷壶(季铵盐:苄基二甲基辛基氯化铵、苄索氯铵、氯化苄乙基铵、三羟乙基胺)

季铵盐作用方式是使脂质变性。分解细胞膜的双层磷脂和增加细胞通透性,导致酶失活,蛋白沉淀,与DNA和RNA产生反应,可有效防止真菌、细菌(和芽孢)和包膜病毒(包括HIV等RNA病毒)的污染和生长。

灭菌彻底;无毒无害;无刺激性;无腐蚀性;可生物降解

不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用,也不能与碘或过氧化物(如高锰酸钾、过氧化氢、磺胺粉等)同用,否则会抵消其作用。

84消毒液

(次氯酸钠)

次氯酸钠消毒杀菌最主要的作用方式是通过它的水解作用形成次氯酸,次氯酸再进一步分解形成新生态氧[O],新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒的蛋白质变性,从而使病原微生物致死。

灭菌彻底;残留性小;价格便宜

有腐蚀;与氨或酸(如洁厕灵)混合时       易释放出有毒氯气

新洁尔灭

(苯扎溴铵)

季铵盐类消毒剂属于阳离子表面活性剂,能吸附带阴离子的细菌并破坏细菌的细胞膜,增加细菌胞浆膜通透性, 使菌体胞浆物质外渗,阻碍其代谢而起到杀灭作用。

可杀灭常见细菌、真菌;刺激性低;无腐蚀

不能与肥皂或其他阴离子洗涤剂同用,也不能与碘或过氧化物(如高锰酸钾、过氧化氢、磺胺粉等)同用,否则会抵消其作用。

来苏尔

(甲酚)

酚类可裂解并穿透细胞壁,使菌体蛋白凝集沉淀,快速杀灭细胞。

可杀灭常见细菌、真菌

刺激性强,易使橡胶制品变脆变硬

滴露(对氯间二甲苯酚)

酚类可裂解并穿透细胞壁,使菌体蛋白凝集沉淀,快速杀灭细胞。

可杀灭常见细菌、真菌

刺激性强,易使橡胶制品变脆变硬



细胞污染杀除试剂


01.细菌克星-抗生素


货号

抗生素

作用对象

使用比例

储存条件

03-049-1B

卡那霉素溶液(10mg/ml)

细菌(如G+、G-、支原体)

稀释:1:100

-20ºC

03-035-1B

硫酸庆大霉素溶液(50  mg/ml)

细菌(如G+、G-、支原体)

稀释: 1:1000

AMB室温

03-031-1B

青链双抗(10,000  units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate)

细菌(如G+、G-)

稀释: 1:100

-20ºC

03-031-5B

青链双抗,10浓缩液(10X Conc., 100,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 100mg/ml,  Streptomycin Sulfate)

细菌(如G+、G-)

稀释: 1:1000

-20ºC

03-032-1B

青链霉素,制霉菌素三抗(10,000  units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250  units/ml Nystatin)

细菌(如G+、G-)、真菌(如:酵母菌、霉菌)

稀释: 1:100

-20ºC

03-033-1B

青链霉素,两性霉素B三抗(10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin  Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B)

细菌(如G+、G-)、真菌(如:酵母菌、霉菌)

稀释: 1:100

-20ºC

03-034-1B

青链霉素,新霉素三抗(10,000  units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 25mg/ml  Neomycin Sulfate)

细菌(如G+、G-)

稀释: 1:100

-20ºC


02.真菌克星-抗生素


货号

抗生素

作用对象

使用比例

储存条件

03-029-1B

两性霉素(2500ug/ml)

真菌(如:酵母菌、霉菌)

稀释:1:1000 ~ 1:  10,000

-20ºC

03-030-1C

制霉菌素(10,000units/ml)

真菌(如:酵母菌、霉菌)

稀释:1:100 to  1:1000

-20ºC

03-032-1B

青链霉素,制霉菌素三抗(10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin Sulfate, 1,250  units/ml Nystatin)

细菌(如G+、G-)、真菌(如:酵母菌、霉菌)

稀释: 1:100

-20ºC

03-033-1B

青链霉素,两性霉素B三抗(10,000 units/ml Penicillin G Sodium Salt, 10mg/ml Streptomycin  Sulfate, 25 ug/ml Amphotericin B)

细菌(如G+、G-)、真菌(如:酵母菌、霉菌)

稀释: 1:100

-20ºC


03.支原体检测试剂




EZ-PCR支原体检测试剂盒(货号:20-700-20)。


支原体检测试剂盒的特异性:
引物与美国国家生物技术中心(NCBI)数据库进行比对,并检测16S,rRNA靶区同源性。96种支原体具有相关序列同源性。 



04.支原体杀除试剂

 



      BIOMYC-1  03-036-1B      

BIOMYC-2  03-037-1B

BIOMYC-3  03-038-1B

 

主要成分:

03-036-1B  太妙菌素

03-037-1B  二甲胺四环素

03-038-1B  环丙沙星





方案一:

BIOMYC-1(03-036-1B)和BIOMYC-2(03-037-1B)的使用方法:

          1. 加 1ml的 BIOMYC-1 溶液至 100ml培养基中,保持受污染的细胞在混合液中培养 4 天。期间需加入含 BIOMYC-1 溶液的少许的新培养基;

          2. 4天后,加1ml BIOMYC-2 溶液至 100ml 的新培养基中,并维持培养 3 天;

          3. 以上是一个处理循环阶段,可继续2-3次如上处理循环。

          4. 在处理过程中,细胞需要做支原体污染检测,以确认效果,从而适当减少实验过程。




 方案二:

        1. BIOMYC-3(03-038-1B)的使用方法:

        2. 加1ml BIOMYC-3至100ml培养基中;

        3. 持续培养14天,期间每2-3天更换一次含BIOMYC-3培养基;

        4. 14天后,用不含BIOMYC-3的完全培养基继续培养细胞14天后再做支原体检测。

        5. 经济考虑,用户选择一种方案即可;最佳方案是,客户先用方案一处理一周期,再用方案二处理一周期。

友情提示:如果使用其中一种方案,不能根除支原体,说明该支原体可能在另一种方案的抑菌谱内;36,37,38三者联合可有效根除实验室95%以上的支原体污染。



05.黑胶虫杀除试剂


      BIOMYC-1  03-036-1B      

BIOMYC-2  03-037-1B

BIOMYC-3  03-038-1B

        主要成分:

        03-036-1B  太妙菌素

        03-037-1B  二甲胺四环素

        03-038-1B  环丙沙星


三抗  03-033-1B

          主要成分:青、链、两性霉素。



黑胶虫杀除方案一:

BIOMYC-1(03-036-1B)和BIOMYC-2(03-037-1B)和三抗(03-033-1B)的使用方法:

                    1. 加1ml的 BIOMYC-1和三抗溶液至100ml培养基中,保持受污染的细胞在混合液中培养4天。期间需加入含BIOMYC-1和三抗溶液的少许的新培养基;

                    2. 4天后,加1mlBIOMYC-2和三抗溶液至100ml的新培养基中,并维持培养 3天;

                    3. 以上是一个处理循环阶段,必要时可继续2-3次如上处理循环。

                    4. 在处理过程中,细胞需要做支原体污染检测,以确认效果,从而适当减少实验过程。


黑胶虫杀除方案二:

                  1. BIOMYC-3(03-038-1B)和三抗(03-033-1B)的使用方法:

                  2. 加1mlBIOMYC-3和三抗溶液至100ml培养基中;

                  3. 持续培养14天,期间每2-3天更换一次培养基;

                  4. 14天后,用不含BIOMYC-3和三抗溶液的完全培养基继续培养细胞14天后再做支原体检测。