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咦?我的细胞被胰酶消化了?
来源: | 作者:佚名 | 发布时间: 2021-10-12 | 421 次浏览 | 分享到:

 

培养细胞的老师们都知道

细胞的生命是极其脆弱的

在培养过程中有哪些行为是比较伤害细胞的呢?

在培养贴壁细胞过程中

消化过程在一定程度上是对细胞的一种折磨

但是又不得不进行这个过程

所以如何做好细胞消化

善待细胞们

是我们一定要了解的步骤~

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胰酶的作用原理

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胰酶是一种蛋白酶,酶切位点是肽链的Lys或Arg两个残基的羧基端肽链,通过在特定位置上降解蛋白,使细胞膜上和培养皿结合处蛋白降解,从而使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力的作用下成为球形。

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使用胰酶时需注意的细节问题

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在使用胰酶(Trypsins)细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。
胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差,做流式时的CD Marker也可能会下降。
胰酶进行分装时尽量分装成多瓶,并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时液体体积会膨胀,多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。
胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞,如胚胎、上皮、肝、肾等组织,但对于纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。胰酶消化效果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度有关。

注意:不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才表示消化好了。
一般肉眼观察贴壁细胞层,只要能移动了,多半呈沙状移动就可以了,这时就应该停止消化。


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如何进行细胞消化

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对大部分细胞消化来说,可以在消化到差不多快要脱落的时候,移除大部分胰酶,然后直接加新鲜的培养基将细胞吹打下来,省去离心步骤。残余的胰酶含量很低,所以不会对细胞产生任何影响。
对于难消化的细胞,如HCT15, LS411和KM12,用不含Ca2+,Mg2+的PBS洗涤一次后,加入稍微多一点胰酶,置37ºC彻底消化(一般为几分钟)至脱落(一晃细胞就掉下来),然后再加培养基终止胰酶反应、离心 (若是无血清培养基,需改加胰酶抑制剂)。这么做的道理是,细胞消化不彻底,势必会增加吹打辅助脱落的次数,而吹打次数越多,细胞活性越差。
若细胞消化过度,可以加入血清终止胰酶对细胞的继续作用,因为血清中含有蛋白可与胰酶结合,利用竞争抑制原理,中和胰酶消化,不能直接用胰酶吹打。应加入过量血清,约为胰酶的1-2倍,然后离心去上清,培养基重悬,这时应该注意将细胞吹散,因为一般胰酶消化过度之后细胞容易聚集成团,不吹散的话会严重影响细胞状态。吹打不宜过猛,20下左右,肉眼完全看不到颗粒状悬浮后再吹几下即可。
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如何选择正确的细胞消化试剂

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BI提供动物来源的传统胰酶及基因工程生产的重组胰蛋白酶。

货号:03-079-1B

动物胰酶普遍用于血清培养,不同的细胞加入胰酶的成分和浓度不一样。贴壁不牢和半贴壁细胞尽量使用浓度0.05%不含EDTA的胰酶且不需要放在培养箱孵育,这样易于控制,对细胞的伤害也降到最低。对于难消化的细胞就需要使用含EDTA的0.25%的胰酶,而不是无限地延长消化时间。
EDTA有什么作用呢?许多人不用胰酶,只用EDTA,或者用胰酶/EDTA联合作用。胰酶切割ECM负责粘连和附着的蛋白,而EDTA通过螯合Ca2+,抑制Integrin的贴壁活性,所以EDTA的作用更加温和。
重组胰酶用于无血清培养。重组胰酶具有与动物源性胰蛋白酶相同的酶学性质,但是不含任何动物源成分,可替代胰蛋白酶使用(常用于细胞治疗)。
BI生产的重组胰酶Recombinant Trypsin EDTA Solution ,堪称传统胰酶的完美替代者。无杂酶,无外源性或内源性病毒污染,无PMSF(蛋白酶抑制剂:苯甲基硫酰氟)、EDTA等任何蛋白酶抑制剂,较传统的胰酶使用方便,在细胞培养实验中减少了很多不必要的操作,细胞培养效果大大提高。


▲ 重组胰酶和动物源胰酶消化后细胞对比图



BI提供的胰酶种类如下表,用户也可根据自己的需求进行选择噢~