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为什么细胞换液或传代后突然“翘辫子”?
来源:原创 | 作者:小元 | 发布时间: 2022-08-04 | 1557 次浏览 | 分享到:

是不是在纠结

细胞换液后养不好

传代后养不好呢?

那么今天就帮大家分析有哪些原因!!!

原因的剖析

    


细胞的污染

营养体系

细胞的“渴死”

PH或渗透压改变

胰酶的消化不当


细胞污染

(1)培养环境导致污染:如果在卫生不达标的环境中培养,那么细胞很容易受到污染最终凋亡,内在环境如培养箱水盘和水浴锅,检查是否进行了消杀。


(2)操作步骤导致污染:

a. 复苏:要用37℃的水没过冻存管瓶盖,轻轻摇动瓶子使其均匀溶解,切勿触碰吸管尖头部或容器瓶口,否则极容易造成污染;

b. 传代:瓶盖的盖口要朝下放置,否则容易染上细菌;其次在传代实验过程中赤膊进入超净台,并且操作前要用75%的酒精棉擦洗双手和前臂,才能进入实验;

c. 冻存:操作前务必要用75%的酒精擦拭无菌操作台面,确保整个实验过程处于一个无菌的状态。


(3)耗材问题导致污染:

出现此类情况可以用电离辐照灭菌:辐照灭菌是利用电离辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法,用于灭菌的射线有:电子束、X射线、γ射线等。

我们可以将培养试剂及辅助试剂等条件不变,用新的耗材(培养皿或培养瓶、枪头)培养细胞,再观察细胞是否有污染问题




营养体系

遇到这种情况时,我们可以用控制变量法:

(1)其他试剂保持不变,用新开封的血清培养细胞,观察细胞状态;

(2)其他试剂保持不变,用新开封的基础培养基培养细胞,观察细胞状态;

(3)当细胞复苏很好,一到传代过程就污染时,其他试剂保持不变,用新开封的胰酶消化细胞,观察细胞状态;

(4)当细胞反复出现污染时,保持培养体系不变,培养其他类型且同样适用于此营养体系的细胞,观察细胞是否有污染

(5)血清批间差的预防及处理办法:

   1.预防措施:先使用血清试用装,试用效果好,可购买和血清试用装批次相同的正装,囤积半年甚至一年的用量,避免批间差造成实验波动(胎牛血清在-20℃保存可达5年)。

   2.处理办法:

      a. 建议加高血清比例到15%或20%

      b. 建议购买ITS(4%胎牛血清+1%ITS+95%基础培养基)

      c. 更换血清批次





细胞“渴死”

培养板倾斜后,没有液体的一面被风机吹干,细胞凋亡,有液体的一面细胞状态正常。


PH或渗透压改变

细胞在换液前用pH或渗透压改变的PBS清洗或换新的培养基时操作不当,这也可能导致细胞污染凋亡。

正确的换液方法:

(1)将孔板竖起来与桌面呈大概30°,为避免直接冲刷细胞面,在底下没有细胞的面上加液,动作要轻柔。

(2)换液过程中要远离酒精灯。

(3)防止细胞暴露时间过长,6孔或12孔的可以一个孔一个孔的换,其他的孔板可以几个孔一起换。

(4)培养基预温37℃,可以按照1-2周的用量来配置,除非有些特殊的添加因子要求现配现用。


胰酶消化不当

(1)胰酶纯度:普通胰酶(0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA)纯度不够高,含有的杂酶如羧肽酶对细胞有伤害,神经元类细胞会比较敏感,如小鼠海马神经元HT22。

(2)胰酶消化不足或过度:消化不足,细胞会粘连在一起,吹打时细胞成片脱落,容易聚团;消化过度,细胞消化严重,破损的细胞碎片容易粘连聚团。

(3)操作不当:吹打过猛,细胞机械损伤大,细胞聚团明显。




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